螃蟹饲料微生物指标检测标准与检测方法

问：螃蟹饲料微生物检测有哪些国家标准？水产饲料卫生指标如何测定？

答：

一、标准名称

1. GB 13078-2017 饲料卫生标准

2. SC/T 3504-2020 水产配合饲料微生物指标的检测

3. GB/T 13091-2018 饲料中沙门氏菌的检测方法

4. GB/T 30956-2014 饲料中霉菌总数的测定

5. GB/T 26428-2010 饲用微生物制剂中菌种的鉴定

二、标准内容

（一）GB 13078-2017

该标准规定水产动物配合饲料中微生物限量指标及检测通则。明确总菌落数≤2×10⁶ CFU/g，大肠菌群≤3×10³ MPN/100g，沙门氏菌不得检出。针对霉菌毒素提出黄曲霉毒素B₁≤10μg/kg，赭曲霉毒素A≤100μg/kg的限量要求。标准附录B列明采样要求：每批次至少采集500g原始样品，四分法缩分至200g检测样，需在4小时内完成初始处理。检测环境需符合二级生物安全实验室标准。

（二）SC/T 3504-2020

行业标准详细规范水产饲料微生物检测操作流程。规定需采用无菌均质器处理样品，转速不低于8000r/min，均质时间3-5分钟。总菌落数检测采用平板计数琼脂，30±1℃培养72±3小时；大肠菌群检测使用VRBA培养基，37℃培养24小时后计数典型紫色菌落。沙门氏菌检测执行"三阶段法"：预增菌使用缓冲蛋白胨水，选择性增菌用TTB和SC培养基，最终采用BS和XLD琼脂分离。标准特别规定检测报告需包含培养基批号、培养箱校准记录。

（三）GB/T 13091-2018

该标准确立饲料中沙门氏菌检测的分子生物学与培养法双重验证体系。前增菌阶段采用1:9样品与灭菌蛋白胨水混合，37℃培养18±2小时。选择性增菌使用四硫磺酸盐煌绿增菌液（42℃）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（37℃），双温度同步培养24小时。分离培养要求同时接种BS琼脂和HE琼脂，典型菌落需进行TSI斜面、赖氨酸脱羧酶等5项生化试验确认。标准新增PCR快速检测法，引物序列为：正向5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'，反向5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'。

（四）GB/T 30956-2014

该标准明确霉菌检测需使用含氯霉素的孟加拉红培养基，氯霉素终浓度0.05g/L。样品预处理要求粉碎过1mm筛，25g样品加入225ml稀释液，振摇15分钟。倾注法接种后，28℃培养5天，第3天开始每日观察。判定标准规定：同一稀释度两个平板菌落数差需小于15%，选取30-150CFU范围计数。对根霉、毛霉等蔓延菌落，采用琼脂覆盖法处理。标准附录给出常见产毒霉菌的显微特征图谱，包括黄曲霉、赭曲霉等6属12种的鉴别要点。

（五）GB/T 26428-2010

标准规定饲用微生物制剂的菌种鉴定需进行16S rRNA基因测序，序列与模式菌株相似度≥99%。芽孢杆菌属需检测接触酶、氧化酶及VP试验，乳酸菌需做碳水化合物发酵试验（检测7种糖类）。标准要求保藏菌种每3个月进行纯度检测，采用TSA平板划线法，观察是否出现异常菌落。对复合菌剂，规定需建立DGGE指纹图谱，电泳条件为8%丙烯酰胺凝胶，电压60V，时间16小时。鉴定报告需包含菌株的菌落形态、革兰氏染色结果及关键生理生化指标。

三、检测方法

总菌落数测定执行GB 13078附录B，称取25g样品加入225ml生理盐水，均质后梯度稀释，选择适宜稀释度倾注平板计数琼脂，30℃培养72小时。沙门氏菌检测依据GB/T 13091，增菌后划线BS琼脂，挑取黑色菌落进行API 20E生化鉴定。霉菌检测按GB/T 30956，样品经粉碎处理后接种含氯霉素的孟加拉红培养基，28℃培养5天，菌落计数仪统计结果。大肠菌群检测采用VRBA培养基倾注法，覆盖无菌琼脂防止需氧菌干扰，37℃培养后计数紫色菌落。分子检测需提取样品DNA，使用沙门氏菌invA基因特异性引物进行实时荧光PCR扩增，Ct值≤35判定阳性。